.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法
(一)保留时间变化
1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 采用保护柱
(二)保留时间缩短
1.流速增加 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 降低样品量
3.键合相流失 流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 柱恒温
(三)保留时间延长
1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化
3.键合相流失 同前(二)3
4.流动相组成变化 同前(二)4
5.温度降低 同前(二)5
(四) 出现肩峰或分*
1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于峰的15%
2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 更换进样器转子
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 处理样品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用剂
5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六) 基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 连接点降至,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
1.进样体积过大 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至
9.样品过载 进小浓度小体积样品
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法
(一)保留时间变化
1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 采用保护柱
(二)保留时间缩短
1.流速增加 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 降低样品量
3.键合相流失 流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 柱恒温
(三)保留时间延长
1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化
3.键合相流失 同前(二)3
4.流动相组成变化 同前(二)4
5.温度降低 同前(二)5
(四) 出现肩峰或分*
1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于峰的15%
2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 更换进样器转子
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 处理样品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用剂
5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六) 基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 连接点降至,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
1.进样体积过大 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至
9.样品过载 进小浓度小体积样品
经验谈 ：
色谱柱在使用前，进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是
佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
a、使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流
动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求柱效，使用流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。加入叠氮化钠，防止细菌生长。
d．流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能
HPLC的常用术语
部分 色谱曲线
1、 romatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图（ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。
2、 （色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 此主题相关图片如下： 此主题相关图片如下：
3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。
4、峰高（h ，peak height）：色谱峰值点到峰底的距离（图1 中的BE）。
5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点（图1 中的F ，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图 1 中的KL）。
6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直 线 与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。
7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。
8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较平缓的不对称的峰。
9、前伸峰（leading peak）：较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）
10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）
12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。
柱的使用和维护注意事项(推荐)
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从溶剂改变为全部是水，反之亦然
③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50"75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100"200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的物）、甲醇、水依次冲洗。
⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1"2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析
柱相同固定相的短柱（5"30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2"9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。
1、样品的前处理：
a、使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流
动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求柱效，使用流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。加入叠氮化钠，防止细菌生长。
d．流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能
HPLC的常用术语
部分 色谱曲线
1、 romatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图（ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。
2、 （色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 此主题相关图片如下： 此主题相关图片如下：
3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。
4、峰高（h ，peak height）：色谱峰值点到峰底的距离（图1 中的BE）。
5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点（图1 中的F ，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图 1 中的KL）。
6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直 线 与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。
7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。
8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较平缓的不对称的峰。
9、前伸峰（leading peak）：较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）
10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）
12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。
柱的使用和维护注意事项(推荐)
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从溶剂改变为全部是水，反之亦然
③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50"75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100"200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的物）、甲醇、水依次冲洗。
⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1"2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析
柱相同固定相的短柱（5"30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2"9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。